참굴, Crassostrea gigas의 해양오염물질 노출에 따른 분자 생리학적 변화

Abstract

카드뮴은 급속한 산업 발달에 따라 복잡하고 다양한 형태로 수서 환경으로 유입되며, 유입된 카드뮴은 그 양이 소량일지라도 수서생물의 체내에 축적되어 먹이사슬을 통해 인간에게도 악영향을 초래한다. 본 연구는 카드뮴이 참굴, Crassostrea gigas의 생리적 변화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 참굴을 카드뮴 (0.01, 0.05, 0.1 ppm)에 노출시킨 후, heat shock protein 90 (HSP90), metallothionein (MT) 및 manganese- superoxide dismutase (Mn-SOD) mRNA의 발현과 헤모림프(hemolymph)내의 hydrogen peroxide (H₂O₂) 농도와 glutamate oxaloacetate trasaminase (GOT) 및 glutamate pyruvate transaminase (GPT) 분석을 실시하였다.

본 연구를 통하여, 참굴 아가미 조직으로부터 전장의 HSP90 cDNA (GenBank accession no. EF687776)와 Mn-SOD cDNA (EU420128)를 분리하였다. 참굴 HSP90 및 Mn-SOD cDNA는 현재 보고된 패류 종과 각각 84%, 62% 이상의 상동성을 나타내었다. 또한 각 단백질의 특이적인 요소와 잘 보존된 영역을 포함하고 있었다.

참굴 HSP90과 MT 및 Mn-SOD mRNA 발현은 카드뮴 처리 농도가 증가함에 따라 mRNA 발현량이 유의적으로 증가하였다. 이는 참굴 체내에서 카드뮴이 독성 스트레스로 작용하였고 이에 세포보호 및 항상성 유지를 위해 HSP90, MT 및 Mn-SOD mRNA의 발현이 유도되었다고 판단된다. 또한 본 실험에서 0.05 ppm과 0.1 ppm 농도에서는 HSP90과 Mn-SOD mRNA 발현이 7일째까지 발현의 증가하다가 이후 11일째 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 카드뮴의 강한 독성에 의해 생체 대사능력의 감소로, 지속적으로 축적된 카드뮴이 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)를 발생시켜, 이로 인한 강한 산화 스트레스에 의해 생체대사능력이 감소하고 이에 따라 생체 방어를 위한 HSP90 및 Mn-SOD mRNA의 발현량도 감소하는 것으로 사료된다. MT mRNA 발현은 카드뮴의 농도와 노출시간에 따라 발현량이 유의적으로 증가하였다. MT는 카드뮴의 생체내 축적 정도를 나타내는 biomarker로, 중금속 농도에 비례하여 상대적으로 증가하는 것으로 알려져 있다. MT mRNA의 발현변화는 노출시간과 농도에 비례하여 참굴 체내에 카드뮴이 축적되었음을 뒷받침 해준다.

참굴의 헤모림프 내의 Hydrogen peroxide (H₂O₂) 농도의 변화 분석한 결과, 카드뮴의 농도가 높을수록, 시간이 경과할수록 증가하는 경향을 나타냈다. 이는 체내 카드뮴의 축적에 의해 산화작용이 유도되었으며 이 과정에서 다량의 ROS가 생성되었음 알 수 있다. 참굴 헤모림프 내의 효소성분인 GOT 및 GPT의 농도는 0.1 ppm 7일째에 유의하게 증가하였다. 이는 카드뮴에 의한 조직손상에 의한 결과로 볼 수 있으며, GOT, GPT 활성이 7일째 유의한 증가는 HSP90과 Mn-SOD mRNA의 발현이 감소하는 시점과 일치하여, 과도한 스트레스에 의한 조직손상의 결과로 추측되어진다.

또한 참굴의 tributyltin (TBT) 노출 실험에서도, Mn-SOD 및 헤모림프 내의 H₂O₂농도와 GOT, GPT 활성이 카드뮴의 노출과 매우 유사한 결과를 나타내었다. TBT는 주석을 포함하고 있는 유기화합물로 해양부착생물방지제 속에 포함되는 강한 독성을 가진 환경오염물질로서 카드뮴과 같이 체내에 독성물질로 작용하여, ROS 생성 및 mRNA 발현 유도에 유사한 메커니즘을 나타내는 것을 알 수 있었다.

결론적으로, 카드뮴의 노출에 의하여 체내에 ROS가 발생하여 산화스트레스를 유도하였고, 이에 스트레스 및 독성 제거와 항상성 유지를 위해 HSP90, MT, Mn-SOD mRNA의 발현이 증가하였다. 또한 카드뮴에 과다하게 노출되면 생체는 활성을 잃게 되어, 산화스트레스에 대한 방어능력의 감소로 조직의 손상을 가져오게 된다. 따라서, 본 연구의 결과는 HSP90, MT 및 Mn-SOD가 카드뮴 독성으로부터의 세포보호와 항상성유지를 위하여 발현됨을 시사하며, mRNA발현 및 헤모림프 내의 H₂O₂농도와 GOT, GPT 활성은 참굴의 스트레스 정도를 판단할 수 있는 생리적 지표로서의 가능성이 기대된다.

Experiment 2

Superoxide dismutases (SODs) are metalloenzymes that play an important role in mollusk immune defense systems by eliminating oxidative stress to reactive oxygen species. Physiological changes were investigated in Pacific oyster Crassostrea gigas caused by exposure to pollutants (cadmium and tributyltin). mRNA expression of manganeses-SOD (Mn-SOD) were analyzed in gills using a quantitative polymerase chain reaction (QPCR), and measured the glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), glutamate pyruvate transaminase (GPT) and hydrogen peroxide (H₂O₂) levels in hemolymph based on time- and dose-related effects of pollutants and acute water temperature treatments. C. gigas Mn-SOD full-length cDNA (965 nucleotides) were cloned that included an open reading frame of 675 nucleotides that was predicted to encode proteins of 225 amino acids. BLAST analysis of other species indicated that residues essential to the enzymatic functions of Mn-SOD proteins are highly conserved. Levels of Mn-SOD mRNA expression, GOT and GOT gradually increased and then subsequently decreased during the experimental periods. On the other hand, H₂O₂ levels increased continuously during the exposure periods. These results suggest that Mn-SOD plays an important role in the physiological changes related to metabolism and cell protection that occur in C. gigas when exposed to oxidative stress by pollutants.