흰동가리 Amphiprion melanopus의 성 성숙 및 성 전환 메커니즘에 관한 분자내분비학적 조절

Abstract

어류의 성 성숙 및 발달은 시상하부-뇌하수체-생식소(HPG) 축을 중심으로 생식소자극호르몬방출호르몬(GnRH), 생식소자극호르몬(GTH)과 스테로이드호르 몬 이외에 신경내분비물질, 생식소호르몬과 같은 다양한 성 호르몬에 의해 조절된다. 본 연구에 사용된 흰동가리 Amphiprion melanopus는 농어목(Perciformes) 자리돔과(Pomacentridae)에 속하는 종으로 암·수 한 쌍 또는 암·수 한 쌍과 미성숙 개체로 그룹을 형성하며 생활한다. 그룹 내에서 이들 개체의 성은 사회적 지위에 의해서 결정되는데, 암컷이 그룹 내에서 가장 크고 제일 높은 서열을 가지게 되며, 암컷이 죽거나 사라지게 되면 수컷이 암컷으로 성 전환을 하고, 미성숙 개체가 수컷으로 성 전환을 하는 대표적인 웅성선숙(protandry)형 어류이다. 따라서 본 연구는 흰동가리의 성 성숙 및 성 전환 과정 동안 HPG 축 활성에 영향을 미치는 유전자의 발현 및 성 스테로이드호르몬의 내분비학적 조절 메커니즘을 규명하기 위하여 수행되었다. 본 연구에서는 흰동가리의 성 성숙 및 성 전환 과정을 확인하기 위해, 암·수 한 쌍과 미성숙 개체로 이루어진 그룹에서 암컷을 제거한 후 60, 90 및 120 일째 수컷 개체를 관찰하였다. 본 연구를 진행하는 동안 수온은 28°C를 유지하였고, 일반 광주기(명기 12 시간: 암기 12 시간)를 사용하였다.

1. 흰동가리의 성 전환 단계별 3가지 타입 GnRH의 발현 변화 및 외인성 GnRH의 영향

GnRH는 어류의 번식과 성숙을 조절하는데 중요한 역할을 수행한다. 본 연구에서는 흰동가리에서 3가지 타입의 GnRH (sGnRH, sbGnRH 및 cGnRH-II) cDNA를 각각 클로닝 하였으며, 흰동가리가 수컷에서 암컷으로 성 전환 과정 동안 3가지 타입 GnRH의 mRNA 발현과 활성을 비교하여 성 전환에 따른 GnRH의 역할을 확인하였다. 그 결과, sGnRH, sbGnRH 및 cGnRH-II mRNA는 성숙한 개체의 정소와 난소에서 유의적으로 높은 발현량을 보였다. 성 전환 과정 동안은 GnRH mRNAs의 발현량이 감소하였다가 암컷으로 성 전환이 이루어지면서 다시 발현량이 증가하기 시작하여, 완전히 성숙한 암컷 생식소에서 가장 높은 발현량을 보였다. 또한, 3가지 타입의 GnRH를 각각 미성숙 개체에 각각 주입한 결과, 3가지 타입의 GnRH mRNA의 발현량(in vivo 및 in vitro) 뿐만 아니라 혈장 내 E2 농도 또한 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 따라서 GnRH는 흰동가리의 HPG 축을 조절하는 데 중요한 역할을 수행하고 있으며, 생식소 발달 및 성 전환과 밀접한 관련이 있는 것으로 사료된다. 또한, 본 연구에서는 3가지 타입의 GnRH 중, sbGnRH가 가장 높은 발현량이 관찰되었는데, 이는 sbGnRH가 다른 2가지 타입의 GnRH에 비하여 시상하부에 많이 분포하고 있기 때문인 것으로 보이며, sbGnRH가 HPG 축을 직접적으로 활성화시켜 흰동가리의 성 전환 및 생식소의 최종 성숙 조절에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 판단된다.

2. 재조합 GTH를 처리한 흰동가리에서 GTH, GTHR 및 Vtg의 발현 변화

GTH는 척추동물의 생식 조절에 중요한 역할을 하고 있는 호르몬으로, 여포자극호르몬(FSH)과 황체형성호르몬(LH)으로 구분된다. 이들 호르몬은 뇌하수체 전엽에서 합성되며, 생식소로 분비되어 각각의 수용체인 FSHR 및 LHR과 결합한 후, 에스트로겐과 테스토스테론과 같은 성 스테로이드를 조절함으로써 생식소의 발달과 성숙을 제어하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 흰동가리의 뇌하수체에서 GTH를 분리하였으며 이를 이용하여 2가지 타입의 재조합 GTH (rFSH, rLH)를 제작하였다. GTH의 발현 변화에 따른 각각의 호르몬 및 수용체와의 상관관계를 조사하기 위해, 미성숙 개체에 rFSH와 rLH를 각각 주입한 후, 경과 시간대별로 3가지의 GTH (GTHα, FSHβ 및 LHβ)와 각각의 수용체(FSHR, LHR) 그리고 Vtg mRNA의 발현(in vivo 및 in vitro) 및 혈장 E2 농도 변화를 관찰하였다. 그 결과, 3가지의 GTH와 각각의 수용체 및 Vtg mRNA의 발현량 모두 증가하였으며, 혈장 E2 농도 또한 증가하였다. 따라서 본 연구에서는 재조합 GTH가 흰동가리의 생식소 발달 및 성 성숙에 직접적으로 영향을 미치고 있음을 확인할 수 있었다.

3. 흰동가리의 성 전환 단계별 ER와 Vtg의 발현량 변화 및 E2의 영향

에스트로겐은 어류를 포함한 척추동물에서 난자 형성, 난황 형성, GTH의 분비, 정소 발달 등과 같은 성 발달 및 성숙 과정 동안 세포핵 내에 존재하는 특이적 수용체인 에스트로겐 수용체(ER)와 결합하여 다양한 기능을 하는 스테로이드호르몬이다. 또한, 간에서 유도되는 비텔로제닌(Vtg)은 ER 관련 경로에 의하여 에스트로겐과 반응하는 난황전구단백질로 ER과 상호작용을 통하여 성 성숙 및 번식을 조절한다. 본 연구에서는 흰동가리가 수컷에서 암컷으로 성 전환이 이루어지는 동안 3가지 타입의 ER (ERα, β1 및 β2)와 Vtg mRNA의 발현량 변화를 비교하였으며, 미성숙 개체에 E2를 복강 주사한 후 ER와 Vtg mRNA의 발현량 및 혈장 E2 농도의 변화를 통해 E2와 이들 유전자간의 상호작용에 대하여 확인하였다. 본 연구 결과, 흰동가리의 성 전환 과정 동안 생식소와 간에서 3가지 타입의 ER과 Vtg mRNA의 발현이 증가되었으며, E2를 복강 주사한 미성숙 개체에서도 3가지 타입의 ER와 Vtg mRNA의 발현량이 증가되었다. 또한, E2가 ER와 Vtg을 직접적으로 조절하여 흰동가리의 성 전환 과정에 있어서 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다.

4. 흰동가리의 성 전환 단계별 caspase-3 mRNA의 발현 변화

Apoptosis는 세포사멸의 유형으로, 생식소에서 apoptosis는 GTH와 생식소 스테로이드 인자를 통해 조절된다. 본 연구에서는 흰동가리에서 caspase-3 cDNA를 클로닝 하였으며, 성 전환 과정 동안 caspase-3 mRNA의 발현량과 활성을 비교하여 흰동가리가 수컷에서 암컷으로 성 전환 과정 동안 caspase-3의 역할에 대해 조사하였다. 그 결과, 미성숙에서 수컷, 수컷에서 암컷으로 성 전환이 이루어지는 동안 apoptosis를 유도하는 caspase-3 mRNA의 발현량이 증가하였으며, 이와 동시에 난모세포의 발달과 더불어 성 성숙 또한 촉진되었음이 확인되었다. 또한, 미성숙 개체에 GnRH analogue를 주입함에 따라 caspase-3 mRNA의 발현량이 증가된 점으로 볼 때, GnRH가 HPG 축을 활성화시켜 생식소 발달에 영향을 미치는 apoptosis를 조절하고 있는 것으로 판단되었다.

5. Kisspeptin이 흰동가리의 성 성숙 및 HPG 축 유전자의 발현에 미치는 영향

Kisspeptin (Kiss)은 RF-amide peptide 그룹에 속하는 신경단백질로, 시상하부의 시삭전영역(POA)에 분포하고 있으며, 척추동물에서는 번식을 조절하는 신경내분비 인자로 알려져 있다. 본 연구에서는 Kiss에 의한 HPG 축의 조절과 성 성숙과의 관련성을 파악하고자 인위적으로 흰동가리 암·수 한 쌍을 만든 후, 각각의 암·수 개체에 Kiss를 주사하였다. Kiss를 주사한 각각의 암·수 개체를 6주간 사육하면서, 2주 간격으로 암·수 개체를 각각 샘플링하여 성 성숙과 직접적으로 관련되어 있는 유전자인 GnRH, GTH, FSHR, LHR, ER 및 Vtg mRNA의 발현량 변화를 조사하였다. 또한, 생식소스테로이드 호르몬의 전구체인 17α-hydroxypregnenolone와 E2, 11-keto- testosterone (11-KT)의 농도를 측정하여 Kiss 처리에 의한 흰동가리의 성 성숙 조절 메커니즘을 조사하였다. 그 결과, Kiss의 처리 시간이 경과함에 따라 3가지 타입 GnRH의 mRNA 발현량 및 혈장 GnRH 농도가 모두 증가하는 경향을 보였으며, GTH mRNA 발현량과 혈장 FSH와 LH 농도뿐만 아니라 FSHR와 LHR mRNA의 발현량 또한 모두 증가된 것으로 관찰되었다. 또한, Kiss 처리에 따라 ER과 Vtg mRNA의 발현 및 혈장 내 17α-hydroxypregnenolone, E2 및 11-KT의 농도가 모두 증가하였으며, 조직학적 관찰 결과에서도 Kiss를 처리한 흰동가리의 암컷과 수컷 생식소 조직에서 성 성숙이 활발히 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과, 시상하부 POA 세포에 존재하는 Kiss는 흰동가리의 암·수 개체 모두에 작용하여 GnRH의 분비를 촉진시키고, HPG 축을 활성화시켜 생식소의 최종 성숙이 이루어지는 동안 중요한 역할을 하고 있는 것으로 판단되었다.