Molecular and Endocrinological Studies on Gonadotropin-Inhibitory Hormone (GnIH) in the Protandrous Cinnamon Clownfish Amphiprion melanopus

Abstract

어류의 성 성숙 및 성 발달은 시상하부-뇌하수체-생식소 축(HPG 축)을 중심으로 생식소자극호르몬방출호르몬(GnRH), 생식소자극호르몬(GTH) 그리고 스테로이드호르몬 이외에도 신경내분비 물질 및 생식소 호르몬과 같은 다양한 성 호르몬에 의해 조절된다. 최근까지 시상하부에 존재하는 여러 신경단백질 중 GnRH만이 GTH의 합성과 방출을 조절하는 것으로 알려져 있었으나, 2000년에 들어서 메추라기 Coturnix japonica의 뇌에서 생식소자극호르몬억제호르몬(GnIH)가 최초로 발견된 이후 척추동물에서는 GnRH만이 번식을 조절하는 것이 아니라, GnIH와 GnRH의 상호작용으로 인하여 번식이 조절되는 것이 밝혀졌다.

본 연구에서 실험어로 사용된 시나몬 Amphiprion melanopus는 수컷에서 암컷으로 성 전환하는 웅성선숙형 어류이다. 일반적으로 2–4 마리가 그룹을 형성해서 생활하고 그룹 내에서는 암컷이 가장 크고 가장 높은 서열을 가지는데, 만약 암컷이 죽거나 제거되는 경우에는 수컷이 그룹 내에게 가장 큰 개체로 성장하면서 암컷으로 성 전환을 하게 되고, 미성숙 개체는 수컷의 성을 갖게 된다. 따라서 본 연구는 GnIH가 시나몬의 성 성숙 및 성 전환 과정에 미치는 영향과 HPG 축을 중심으로 합성과 분비를 조절하는 유전자의 발현 및 성 스테로이드호르몬의 내분비학적 조절 메커니즘을 규명하기 위하여 수행되었다.

1. 시나몬의 성 전환 단계별 GnIH 발현에 미치는 재조합 GnIH 및 sbGnRH의 영향

GnIH는 번식과 성숙 메커니즘을 조절한다고 알려져 있는 RF-amide peptide 그룹에 포함되어 있으며, 어류를 포함한 척추동물의 시상하부에서 GnRHs (sGnRH, sbGnRH 및 cGnRH-II)와의 상호작용을 통해 번식을 조절할 뿐만 아니라, 뇌하수체에도 작용하여 GTHs (GTHα, FSHβ 및 LHβ)의 합성과 방출을 억제하는 역할을 한다.

본 연구에서는 GnIH가 시나몬의 성 전환에 미치는 영향과 HPG 축을 중심으로 합성과 분비가 조절되는 유전자 및 호르몬과의 상호 관련성을 파악하고자, 성 전환 단계(미성숙, 수컷 및 암컷)별 개체에 재조합 GnIH, sbGnRH 및 GnIH+ sbGnRH를 각각 0.1 µg/g의 농도로 주사한 후 24시간 동안 6시간 간격으로 sbGnRH, GTHs (GTHα, FSHβ 및 LHβ), GnIH 그리고 GnIH 수용체(GnIH-R) 유전자의 발현량 변화를 조사하였다. GnIH를 주사한 경우에는 sbGnRH와 GTHs 유전자 발현량은 유의하게 감소하였으나, GnIH 및 GnIH-R 유전자의 발현량은 유의하게 증가하였다(P < 0.05). 그러나 sbGnRH를 주사한 경우에는 GnIH를 주사한 결과와는 반대되는 경향이 관찰되었다. 특히, 미성숙 개체에 비하여 성숙한 개체(수컷 및 암컷)에서 유전자 발현량이 높게 나타난 점으로 보아, 재조합 GnIH는 시나몬의 성 성숙 및 성 전환 조절을 억제하는 역할을 하며, 미성숙 개체에 비하여 성숙한 개체에 더 큰 영향을 미치는 것으로 판단되었다.

2. 시나몬의 성 전환 과정 동안 GnIH와 멜라토닌 수용체 유전자의 발현 및 멜라토닌의 농도 변화

어류의 성 성숙 및 성 발달은 시상하부-뇌하수체-생식소 축(HPG 축)을 중심으로 GnRH, GTH 및 스테로이드호르몬 이외에도 신경내분비 물질, 생식소호르몬과 같은 다양한 성 호르몬에 의해 조절된다. 특히, 멜라토닌은 송과체와 망막에서 분비되는 호르몬으로, 밤에 증가하고 낮에 감소하는 일주기성 생체리듬 조절과 밀접한 관련이 있는 신경내분비적 신호로 작용한다. 멜라토닌은 멜라토닌 수용체(MT-R)와 결합하여 개체의 성장을 촉진시키는 역할도 수행하지만, FSH와 LH의 분비를 감소시켜 성 성숙을 억제시키기도 한다. 뿐만 아니라, 뇌의 시상하부에 위치하는 GnIH 신경세포에 MT-R이 존재하는 점으로 보아, 송과체와 망막에서 분비되는 멜라토닌은 GnIH 유전자의 발현 조절과 밀접한 연관이 있는 것으로 판단된다.

따라서 본 연구에서는 시나몬의 성 전환 과정 동안 GnIH와 멜라토닌과의 상호 관련성에 대하여 조사하기 위하여, 성 전환 단계별(성숙한 수컷 개체, 암컷 제거 후 90일째의 성 전환 중인 개체, 성숙한 암컷 개체) 시나몬을 대상으로 GnIH, GnIH-R 및 MT-R mRNA 발현량 변화 및 혈중 멜라토닌 농도를 측정하였다. 뿐만 아니라 간뇌의 시상하부에서 주로 합성되어 분비되는 GnIH 및 MT-R을 면역형광기법으로 이중 형광 염색하여 성 전환 단계별로 발현량 차이를 관찰하였다. 그 결과, 성 전환 중인 개체에서는 GnIH, GnIH-R 및 MT-R 유전자 발현량이 모두 감소하였다. 또한, 간뇌에서 GnIH 및 MT-R을 이중 형광 염색한 결과, GnIH 및 MT-R은 서로 동일한 부위에서 발현되었으며, 성 전환 중인 개체에서는 발현량이 유의하게 감소하였다(P < 0.05). 따라서 멜라토닌은 GnIH와의 상호작용을 통하여 시상하부-뇌하수체-생식소 축의 활성을 억제시킴으로서 시나몬의 성 전환에 관여하고 있는 것으로 판단된다.

3. 코르티솔을 처리한 시나몬에서 GnIH 및 sbGnRH의 발현 변화

다양한 요인에 의해 발생하는 스트레스는 성 성숙을 억제시키는 원인으로 작용하는데, 시상하부-뇌하수체-신간체 축(HPI 축)을 중심으로 분비되는 호르몬인 코르티솔은 당질코르티코이드 수용체(GR)와의 결합을 통하여 시상하부-뇌하수체-생식소 축(HPG 축)의 활성을 억제시켜 척추동물의 번식생리학적 측면에 부정적인 영향을 미친다. GnIH는 GnRH 신경세포에 존재하는 GnIH-R과 결합을 통하여 GnRH의 합성과 방출을 직접적으로 억제시킬 뿐만 아니라, 뇌하수체 전엽에도 작용하여 FSH와 LH의 분비를 억제시킴으로써 척추동물의 성숙을 지연시킨다. 또한, GnIH 신경세포에는 GR이 존재하기 때문에 HPI 축의 활성 변화는 GnIH의 조절에 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 연구에서는 성 성숙 지연 메커니즘과 관련하여 코르티솔과 GnIH와의 상호작용을 파악하고자, 시나몬에 코르티솔을 농도별(10, 50 μg/g)로 주사하여 성 성숙에 영향을 미치는 유전자의 발현과 호르몬의 농도 변화를 조사하였다. 그 결과, 코르티솔 농도가 증가할수록 GnIH, GnIH-R 유전자의 발현은 유의하게 증가하였으나, sbGnRH 유전자의 발현과 혈장 내 FSH 및 LH 농도는 유의적으로 감소하였다(P < 0.05). 또한, 면역형광기법을 활용하여 간뇌의 시상하부 부위에서 GnIH 및 GnRH의 발현을 관찰한 결과, 동일한 부위에서 발현되었으며, 코르티솔을 주사한 실험군에서는 GnIH 발현이 유의적으로 증가하였으나, GnRH 발현은 유의적으로 감소하였다(P < 0.05). 따라서 코르티솔은 GnIH와의 상호작용을 통하여 시나몬의 성숙을 억제시키는 역할을 하는 것으로 판단된다.