Effect of Various Light Spectra on the Physiological Responses of Juvenile Rock Bream Oplegnathus fasciatus by Changes in Water Temperature

Abstract

Water temperature is an important factor involved in the growth, immunity, maturation, and in the physiological adjustment of fish (Maule et al., 1989; Bly and Clem 1992; Bowden 2008). Rapid change in temperature is an environmental stress for fish that causes an increase in reactive oxygen species (ROS), such as superoxide (O2-) anion, hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (OH-), and single oxygen (1O2) (Roch 1999). The excessive production of ROS as a result of environmental stress induces physiological disorders, such as a decrease in disease resistance and reproductive ability because of denaturation of cellular nucleic acids and proteins and loss of their functions, as well as because of the promotion of lipid peroxidation that adversely damages cell membrane and affects cell viability (Kim and Phyllis 1998; Pandey et al., 2003). In addition, ROS is known to have a negative effect on immune function because it decreases the activity of lysozyme (Wang et al., 2008).

Living organisms possess antioxidant defense mechanisms to protect themselves from oxidative stress caused by ROS and to maintain homeostasis. These antioxidant defense mechanisms mainly involve the activity of antioxidant enzymes, such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPX) (Mcfarland et al., 1999).

The immunity of fish is particularly influenced by external factors, such as change in water temperature due to the environmental characteristics of the habitat (Magnadottir 2010). Lysozyme, which is one of the important indicators of the level of immunity, is known to destroy the invading bacterial pathogens by damaging their cell wall during the process of phagocytosis (Saurabh et al., 2008; Shin et al., 2014). In addition, melatonin, a powerful antioxidant, has been reported to function in the direct removal of ROS as well as in enhancing immunity (Reiter et al., 1997; Gülçin et al., 2009; Carrillo-Vico et al., 2013).

Apoptosis, which is characterized by DNA fragmentation and cellular shrinkage, akin to morphological incidents, is regulated by caspases belonging to the cysteine protease family (Alnemri 1997). Caspase-3 is known to play an important role in the process of apoptosis, which is influenced by DNA damage and inflammation caused by biochemical and morphological processes (Häcker 2000).

When fish are exposed to rapid changes in water temperature, heat shock proteins (HSPs) are produced in large quantities. In particular, HSP70 is highly expressed in various tissues and is known to play an important role in cellular metabolism (Nakano et al., 2002).

In addition, cortisol which is a well-known indicator of the stress response is produced in the fish body to maintain homeostasis when the fish is exposed to environmental stress, such as rapid changes in water temperature (Beato et al., 1996; Bonga, 1997). Cortisol is secreted through activation of the hypothalamus - pituitary - interrenal gland axis (HPI axis); the first reaction in this process is the release of corticotropin-releasing hormone from the hypothalamus (Bonga, 1997), followed by secretion of adrenocorticotropic hormone from the anterior pituitary gland, inducing cortisol synthesis in the inter-renal cells of the head kidney (Bonga, 1997; Flik et al., 2006). Cortisol has been reported to directly increase the plasma concentrations of glucose, which is used as an energy source in cell metabolism, by promoting cortisol-mediated gluconeogenesis in the body in response to cell damage caused by stress (Begg and Pankhurst, 2004; Small, 2004).

In addition, stress caused by the external environment may cause liver damage (Cheng et al., 2005; Choi et al., 2015). Aspartate aminotransferase (AspAT) and alanine aminotransferase (AlaAT) are well known indicators of liver damage (Nemcsók et al., 1990).

The physiological stress responses of fish are mainly controlled by the endocrine system. In particular, light is an environmental factor that greatly influences the endocrine system (Pierce et al., 2008; Jin et al., 2009). Recently, various physiological effects of different wavelengths of light from light-emitting diodes (LEDs) on fish have been studied (Villamizar et al., 2009; Choi et al., 2012; Song et al., 2016). LEDs have been shown to be effective for influencing fish culture (Villamizar et al., 2009; Choi et al., 2015).

In the present study, I investigated the effects of specific wavelengths of light in the regulation of oxidative stress induced by an environment of high temperature, by analyzing the changes in mRNA and protein expression and the enzymatic activities of SOD, CAT, and GPX in juvenile rock bream exposed to a high temperature environment (25 and 30°C) and different sources (fluorescent, green, and red LEDs) as well as different intensities (0.25 and 0.5 W/m2) of light. In addition, I measured H2O2 levels to determine the level of fluctuation in stress under the different conditions, and also measured the concentrations of lysozyme and melatonin as immunological indicators. And I also investigated environmental stress (high temperature) by analyzing changes in HSP70 mRNA and cortisol and glucose levels to determine fluctuations in stress under different conditions and measured the concentrations of AspAT and AlaAT to determine the effects of stress on the liver. Finally I also measured the DNA damage and in liver cells of fish as a consequence of apoptotic activity by analyzing the changes in the expression and activity of caspase-3 mRNA and nuclear DNA damage by conducting a terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay and comet assay.|본 연구는 고수온 환경에 돌돔 Oplegnathus fasciatus를 노출시킨 후, 다양한 파장의 빛을 조사하면서 돌돔 체내에서 스트레스와 면역 반응을 포함한 생리학적 변화를 확인하기 위하여 수행되었다. 다양한 빛 파장에 의한 돌돔의 생리학적 반응을 관찰하기 위하여 분자생물학적 실험 방법을 통하여 비교·분석하였다.

1. 고수온 노출에 따른 돌돔의 항산화 반응 및 면역시스템에 미치는 빛 파장의 영향

본 연구에서는 고수온 환경에 노출된 돌돔의 체내에서 생성된 산화스트레스의 조절 및 면역지표 그리고 세포사멸에 미치는 특정 빛 파장의 효과를 확인하기 위하여, 돌돔을 고수온 환경(25 및 30°C)에 노출시킨 후 특정 빛 파장(형광등, 녹색 및 적색)을 세기별(0.25 및 0.5 W/m2)로 조사하면서 생리학적 변화를 관찰하였다.

하루에 수온을 1°C씩 상승시키는 수온 변화 환경(20 → 30°C)에 돌돔을 노출시킨 후, 수온 스트레스 요인에 의하여 어체 내에서 생성되는 활성산소를 제거하기 위한 항산화 물질[superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) 및 glutathione peroxidase (GPX)] 및 면역 지표(melatonin 및 lysozyme)의 변화를 분석하였다. 또한, 급격한 수온 변화에 따른 돌돔의 세포사멸 반응을 확인하기 위하여 caspase-3 및 hydrogen peroxide (H2O2)를 측정하였으며, 간 조직 내에서의 세포사멸 정도는 terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay을 통하여 확인하였다.

급격한 수온 변화는 돌돔 체내에서 SOD, CAT, GPX mRNA 및 단백질 발현량 그리고 효소 활성을 유의적으로 증가시켰지만, 녹색 LED 파장을 조사한 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m2)와는 상관없이 항산화 유전자 및 단백질 발현 그리고 효소 활성은 유의적으로 감소되었음이 확인되었다. 또한, 본 연구에서는 고수온 노출에 따른 돌돔의 면역력 변화를 광원별로 비교한 결과, 녹색 LED 파장 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m2) 와는 상관없이 항산화 유전자 및 단백질 발현 그리고 효소 활성이 유의적으로 감소되는 경향이 확인되었다. 혈장 내 caspase-3 및 H2O2 농도 수준을 분석한 결과에서도 고수온(25 및 30°C) 환경에 노출된 돌돔의 혈중 caspase-3 및 H2O2 농도는 고수온에 노출된 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보였으나, 녹색 LED 파장 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m2)와는 상관없이 유의적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 고수온 노출이 돌돔 간세포의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 TUNEL assay를 실시한 결과, 30°C 고수온 실험구의 돌돔 간세포에서 세포사멸이 가장 많이 유발되었으나, 녹색 LED 파장을 조사한 30°C 실험구에서는 오히려 세포사멸이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

이상의 연구 결과를 종합하여 보면, 25°C 이상의 고수온 환경에 돌돔을 노출시킨 경우, 어체 내에서는 산화스트레스가 유발되었으며 이러한 산화스트레스에 대응하기 위하여 항산화 물질인 SOD, CAT, GPX mRNA 및 단백질 발현 그리고 효소 활성이 유의적으로 증가된 것으로 사료된다. 그러나 녹색 LED 파장의 조사는 오히려 산화스트레스를 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 25°C 이상으로의 수온 변화는 돌돔 체내에서 H2O2 농도를 증가시켜 caspase-3 활성을 유도함은 물론 결국에는 세포사멸까지도 유발시키는 것으로 사료된다. 즉, 고수온 환경은 어류에게 생리적 스트레스를 유발시키지만, 녹색 파장의 빛은 오히려 산화스트레스를 감소시키는 역할을 하며, 0.25 W/m2의 낮은 광량(세기)만으로도 항산화 능력 및 면역력을 증진시키는데 효과적인 것으로 판단되었다.

2. 고수온 노출에 따른 돌돔의 생리적 스트레스 및 DNA 손상에 미치는 빛 파장의 영향

본 연구에서는 고수온 환경에 노출된 돌돔의 체내에서 생성된 생리적 스트레스 및 핵 내 DNA의 손상에 미치는 특정 빛 파장의 효과를 확인하기 위하여, 돌돔을 고수온 환경(25 및 30°C)에 노출시킨 후 특정 빛 파장(형광등, 녹색 및 적색)을 세기별(0.25 및 0.5 W/m2)로 조사하면서 생리학적 변화를 관찰하였다.

하루에 수온을 1°C씩 상승시키는 수온 변화 환경(20 → 30°C)에 돌돔을 노출시킨 후, 수온 스트레스 요인에 의하여 손상된 단백질을 복구하기 위하여 생성되는 heat shock protein (HSP) 70의 변화를 분석하였다. 그리고 hypothalamus-pituitary-interrenal axis (HPI 축)을 중심으로 조절되는 생리학적 스트레스 반응(cortisol 및 glucose)과 스트레스로 인하여 발생되는 간 손상 정도를 확인하기 위하여 aspartate aminotransferase (AspAT)와 alanine aminotransferase (AlaAT) 값을 측정하였다. 또한, 고수온 노출에 따른 간세포 내 핵 DNA의 손상 정도를 확인하기 위하여 comet assay를 실시하여 분석하였다.

수온이 변화함에 따라 돌돔 체내에서는 HSP70 mRNA의 발현과 혈장 내 cortisol, glucose, AspAT 및 AlaAT 농도가 유의적으로 증가하였으며, 특히 30°C 고수온 실험구에서 가장 높게 증가하였다. 그러나 녹색 LED 파장을 조사한 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m2)와는 관계없이 HSP70 mRNA의 발현과 cortisol, glucose, AspAT 및 AlaAT 농도가 유의적으로 감소하는 경향이 확인되었다. 또한, 고수온에 노출된 돌돔의 간세포 내 핵 DNA 손상 정도를 대조구와 비교해 본 결과, 30°C 실험구의 돌돔 간세포에서 더 많은 손상이 발생하였지만, 녹색 LED 파장을 조사한 30°C 실험구에서는 핵 DNA의 손상 정도가 감소된 것이 관찰되었다.

이상의 연구 결과를 종합하여 보면, 25°C 이상의 고수온 환경에 돌돔을 노출시킨 경우, 어체 내에서는 HSP70 mRNA의 발현 그리고 cortisol, glucose, AspAT 및 AlaAT 농도가 유의적으로 증가하였을 뿐만 아니라 간세포 내 핵 DNA가 손상되는 등 생리적 스트레스가 다량으로 발생되었다. 그러나 녹색 LED 파장의 조사는 스트레스와 간세포 내 핵 DNA의 손상을 감소시키는 것으로 나타났으며, 특히 0.25 W/m2의 낮은 광량(세기)의 조사만으로도 고수온에 의한 스트레스를 감소시키는데 효과적인 것으로 판단되었다.