Studies on the Effect of Ocean Acidification in the Physiological Responses of the Olive Flounder Paralichthys olivaceus

Abstract

Owing to the increased use of fossil fuels, atmospheric CO2 concentrations are continuously increasing, which furthers climate change and ocean acidification. In marine organisms with a skeleton of carbonate (calcium carbonate, CaCO3), ocean acidification adversely affects calcium ion homeostasis and metabolism as well as larval nutrient intake, growth, development, and skeleton formation, and it affects neurotransmitters in fish. Moreover, ocean acidification may cause behavioral and olfactory dysfunctions as well as circadian rhythm disturbances in fish. Water temperature, salinity, and pH are major environmental factors affecting the survival and distribution of marine organisms, and changes in these factors adversely affect survival, growth, morphology, and behavior of marine organisms. Such changes also act as environmental stressors through adverse effects on various physiological mechanisms, including neuronal signaling, osmotic regulation, cellular homeostasis, and oxidative stress. In addition, these environmental stressors may induce oxidative stress in fish. Although rapid changes in the marine environment, including the photoperiod, are important environmental factors that can affect the survival of fish, knowledge on how changes in CO2 concentration in seawater directly or indirectly affect the circadian rhythms of fish is still limited. In addition, many studies on environmental changes in the ocean examined physiological responses of fish to changes in single environmental factors such as salinity, water temperature, or toxicity. However, in predicted future marine environments, acidification, warming, and salinity changes are expected to occur simultaneously. Therefore, to conduct more comprehensive studies on ocean acidification, it is necessary to investigate the cumulative effects of environmental factors (pH, water temperature, and salinity) on marine life. Present study investigated changes in the circadian rhythm of olive flounder in an acidified environment. In addition, to confirm oxidative stress and antioxidant responses in olive flounder to combined warming and acidification and to combined hyposalinity and acidification, endocrine responses were investigated.

1. Circadian rhythm disturbances due to exposure to acidified conditions and different photoperiods in juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus Carbon dioxide (CO2) is being continuously discharged into the atmosphere and is now at a concentration sufficient to cause ocean acidification. In particular, it has been reported that changes in carbonate concentration in seawater by ocean acidification can inhibit olfactory function and predator avoidance ability in fish and affect their circadian rhythm. However, although increased CO2 concentration in seawater is an important environmental factor affecting fish survival, only a few studies have been conducted to evaluate the effect of CO2 and different photoperiods. Therefore, in present study, I investigated changes in the circadian rhythm of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus under different light conditions (12 h ligh:12 h dark; constant dark; constant light) and CO2 exposure levels (pH 8.1, 7.8, and 7.5), by analyzing changes in plasma concentrations of Cryptochrome1 and Period2, which are secreted during the day (light conditions), and melatonin, which is secreted at night (dark conditions). CO2 exposure led to phase shifts (temporarily abolished, phase delayed, or reversed) in the rhythm of juvenile. In conclusion, CO2 exposure, along with changes in photoperiods, increases the disturbance in the circadian rhythm of juvenile P. olivaceus.

2. The effects of low pH and high water temperature on oxidative stress and cell damage in juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus: Comparison of single and combined environmental conditions The use of fossil fuels by anthropogenic activities causes ocean acidification and warming, and these changes in the marine environment can negatively affect the metabolism, growth, and survival of fish. In the present study, we evaluated the ability of olive flounder Paralichthys olivaceus to cope with future marine environment changes by investigating the oxidative stress (cortisol, HSP70), antioxidant enzyme (superoxide dismutase; SOD, catalase; CAT) activity, and apoptosis (caspase-3) after exposure to warming (30 °C) and acidification (pH 7.5) conditions and a combined environment (30 °C + pH 7.5) for 28 days Under warming conditions, continuous oxidative stress and increased activity of antioxidant enzymes and apoptosis were observed. Acidifying conditions showed negative effects at the beginning of exposure, but these effects were offset over time. Even in a combined environment of acidification and warming, negative effects were seen only at the beginning of exposure and were not sustained. In conclusion, the effects of acidification on oxidative stress, antioxidant response, and apoptosis in P. olivaceus did not exceed the effects of warming. These results suggest that P. olivaceus can cope with the predicted future acidifying environment.

3. Effect of low pH and salinity conditions on the antioxidant response and hepatocyte damage in juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus Climate change due to increasing CO2 emissions results in the increase in water temperatures, which is accompanied by the decrease in pH and salinity levels of the ocean. Ocean acidification reflects the gradual pH reduction due to changes in the carbon chemistry, which is caused by the increase in anthropogenic CO2 emissions. The subsequent changes in the water temperatures and carbon chemistry of the oceans affect the survival and distribution of aquatic animals. In this study, we analyzed the levels of cortisol, superoxide dismutase, catalase, and caspase-3 in the plasma of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus under combined hyposalinity and acidification. To evaluate the physiological response to these changes, the superoxide dismutase activity and apoptosis were analyzed in the liver cells. Hyposalinity caused oxidative stress and cell damage, while also activating the antioxidant system. Environmental acidification affected the stress response and antioxidant mechanism of P. olivaceus in the early stage of acclimation but did not appear to exceed hyposalinity stress. These findings suggest that a hyposaline environment may be a stronger environmental stressor than an acidifying environment for P. olivaceus, and will help understand the capacity of P. olivaceus to cope with expected future ocean acidification.

최근 화석 연료의 사용 증가로 인한 대기 중의 CO2 농도의 증가는 지구 온난화뿐만 아니라 해양 산성화를 야기하는 등 부정적인 영향을 미치고 있다. 특히, 해양 산성화는 탄산염 골격(탄산칼슘, CaCO3)을 형성하는 유기체의 칼슘 이온 항상성과 신진대사뿐만 아니라 자어의 성장 및 발달, 골격 형성에도 부정적인 영향을 미친다. 또한, 어류의 신경 전달 물질의 분비에도 부정적인 영향을 끼쳐 어류의 행동 및 후각 기능의 이상뿐만 아니라 일주기 리듬의 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 해양 산성화 현상을 비롯한 해양 환경 변화는 해양생물의 생존, 성장, 형태 및 행동에 부정적인 영향을 미친다. 특히, 어류와 같은 해양생물의 경우에 pH, 수온 및 염분 변화는 스트레스 요인으로 작용하여 어류의 신경 신호 전달, 삼투압 조절, 세포 항상성 및 산화 스트레스를 비롯한 다양한 생리학적 메커니즘에 부정적인 영향을 미친다. 최근 지구 온난화와 더불어 해양 산성화가 급격하게 확산되고 있는 문제가 전 셰계적으로 이슈가 되고 있다. 해양 산성화의 기본은 해수 중 CO2 농도의 증가로 인한 pH의 변화이며, 이러한 pH의 변화가 해양생물에 영향을 줄 수 있음에도 불구하고 해양생물의 생리학적 반응 및 변화에 대한 연구는 미진한 편이다. 해양생물 생리 반응의 기본이 되는 일주기 리듬에 미치는 영향에 대한 정보 또한 여전히 제한적이다. 해양의 환경 변화는 pH, 염분 및 수온 변화와 같은 단일 조건의 변화가 아니라, 산성화와 온난화(수온) 그리고 염분의 변화가 동시에 일어나기 때문에 포괄적인 해양 산성화 관련 연구를 수행하기 위해서는 해양생물에 미치는 환경 변화 요인(pH, 수온 및 염분)을 복합적으로 구성하여 그 영향에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다. 따라서 본 연구에서는 국내 양식 어류 생산량 중에서 가장 높은 비중을 차지하고 있는 넙치를 실험 대상 종으로 선정하여, 기후 변화로 인해 예측되는 미래의 해양 산성화가 넙치의 생리학적 반응에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하였다. 해수의 pH 변화에 따른 산성화 환경에서 넙치의 일주기 리듬 변화를 확인하고, 고수온과 산성화 그리고 저염분과 산성화가 결합된 복합 환경에 넙치를 노출시킨 후, 넙치의 산화스트레스 및 항산화 반응을 확인하기 위하여 다양한 생리학적 분석 방법을 활용하여 본 연구를 진행하였다.

1. 산성화 환경과 광주기 변화가 넙치의 일주기 리듬에 미치는 영향 화석 연료의 사용으로 인한 지속적인 CO2의 배출은 해수의 탄산염 농도 변화를 유발하고 이로 인한 해양 산성화는 어류의 신경전달물질 분비 조절에 영향을 끼쳐 후각 기능과 포식자 회피 능력의 이상 현상을 보일 뿐만 아니라 일주기 리듬에도 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 해수 내 CO2 농도의 증가가 어류의 일주기 리듬의 혼란을 야기할 수 있는 중요한 환경 요인임에도 불구하고, CO2가 어류의 일주기 리듬에 미치는 영향에 관한 연구는 거의 찾아 보기 힘들다. 따라서 본 연구에서는 3가지 광주기 조건(12시간 빛을 조사, 12시간 빛을 차단한 실험군, LD; 24시간 동안 지속적으로 빛을 조사한 실험군, LL; 24시간 동안 빛을 차단한 실험군, DD)과 CO2 노출 정도에 따라 3가지 pH 조건(8.1, 7.8 및 7.5)을 설정한 후, 각각의 실험군별로 빛이 존재하는 주간에 분비되는 Cryptochrome1과 Period2의 혈장 농도 변화 그리고 밤의 호르몬으로 알려져 있는 야간에 분비되는 멜라토닌의 활성 변화를 분석하였다. 그 결과, Cryptochrome1과 Period2는 pH 8.1 실험군의 경우, LL에서 높은 활성을 보였고 DD에서는 낮은 활성을 보였다. 한편, 산성화 실험군(pH 7.5)에서는 DD 조건임에도 불구하고 Cryptochrome1과 Period2의 활성이 높고 낮음을 반복하는 등 비정상적인 일주기 리듬이 관찰되었다. 멜라토닌의 변화는 대조군에서 21시에 높은 수준의 활성을 보였으나 새벽 1시로 가면서 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 그러나 산성화 조건에서는 CO2 노출 초기부터 멜라토닌의 분비가 현저히 감소하고 일주기 리듬이 일시적으로 깨지는 현상을 보였으며, DD 조건에서는 멜라토닌이 최대 값을 나타내는 시간이 지연되는 등 위상 지연 현상이 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때, CO2 노출로 인한 해수의 산성화 환경에서 넙치 치어의 일주기 리듬의 위상 이동(일시적인 깨짐 현상, 위상의 지연 또는 역전)이 나타난 점으로 보아, 해수의 산성화는 광주기 변화와 더불어 넙치 치어의 일주기 리듬의 교란을 증가시키는 요인으로 작용한 것으로 판단된다.

2. 산성화와 고수온 환경이 넙치 치어의 산화스트레스 및 세포 손상에 미치는 영향 산업혁명 이후 인간의 인위적인 활동으로 인하여 배출량이 증가된 CO2는 해양 산성화와 온난화를 유발한다. 이 두 현상은 필연적으로 동시에 일어날 것으로 예측되기 때문에 해양 산성화 관련 연구를 수행하기 위해서는 pH 혹은 고수온 변화만의 단일 환경 요인의 변화가 아니라 pH와 수온이 결합된 복합 환경 요인이 해양생물에 미치는 영향에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이러한 복합적인 환경은 어류의 대사, 성장 및 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 지질의 과산화 현상에도 영향을 끼쳐 세포 손상을 발생시키기도 한다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 해양 산성화(낮은 pH)와 온난화(고수온)의 복합 환경을 구성하기 위하여, CO2 노출 정도에 따라 2가지 pH 조건(8.1과 7.5)과 3가지 수온 조건(20, 25 및 30℃)을 복합적으로 구성하여 다음과 같은 실험구를 설정하였다. 1. 대조구(pH 8.1 + 20℃), 2. 고수온 단일 환경 실험구(pH 8.1 + 25℃, pH 8.1 + 30℃), 3. 산성화 단일 환경 실험구(pH 7.5 + 20℃), 4. 산성화와 고수온이 결합된 복합 환경 실험구(pH 7.5 + 25℃, pH 7.5 + 30℃). 넙치 치어를 각각의 실험구 환경에 노출시킨 후, cortisol과 HSP70의 활성 변화를 통하여 스트레스 반응을 확인하였고, 항산화 효소인 SOD와 CAT의 활성 변화를 통하여 항산화 반응을 조사하였다. 또한, caspase-3 활성과 TUNEL 분석을 통하여 스트레스로 인하여 유발된 세포사멸 정도를 조사하였다. 그 결과 cortisol 활성은 고수온 단일 환경과 고수온과 산성화 환경이 결합된 복합 환경 모두에서 수온이 높을수록 높은 활성을 보였다. 산성화 단일 환경에서 cortisol은 대조구에 비하여 높은 활성을 보였으며, 노출 14일차에는 고수온 단일 환경과 고수온과 산성화 환경의 복합 환경 보다도 더 높은 활성을 보였다. SOD는 전반적으로 고수온 단일 환경과 고수온과 산성화 환경의 복합 환경 모두에서 수온이 높을수록 높은 활성을 나타내었으나, CAT 활성은 노출 시간(14일차 이후)이 경과함에 따라 고수온 단일 환경 보다는 고수온과 산성화의 복합 환경에서 지속적으로 높은 활성을 유지하였다. Caspase-3 또한 수온이 높을수록 높은 활성을 나타내었으며, 산성화 단일 환경에서도 높은 활성을 나타내었다. TUNEL 분석 결과에서도 고수온 단일 환경 및 고수온과 산성화의 복합 환경 모두에서 수온이 높을수록 세포사멸의 빈도가 높아졌다. 산성화 단일 환경 14일차 실험구에서는 고수온 단일 환경 및 고수온과 산성화의 복합 환경 실험구와 유사하게 넙치에서 높은 빈도의 세포 손상이 관찰되었다. 이상의 결과로 볼 때, 넙치 치어는 고수온 단일 환경과 고수온과 산성화 환경의 복합 환경 모두에서 산화스트레스와 세포사멸 정도가 유의적인 차이 없이 유사하게 증가하였다. 즉, 고수온(온난화) 단일 환경과 고수온(온난화)과 산성화의 복합 환경이 넙치 치어의 산화스트레스에 미치는 영향이 거의 동일하게 나타난 점, 고수온 환경이 아닌 상대적으로 낮은 수온(20℃)에서 오히려 산성화의 영향이 더 크게 나타난 점, 그리고 산성화 단일 환경 보다는 고수온 단일 환경에서 넙치의 산화스트레스 및 항산화 활성이 더 높게 나타난 점 등으로 볼 때, 해양 산성화가 넙치 치어의 산화스트레스 및 항산화 기작에 영향을 끼치고 있음은 확인할 수 있었지만, 고수온(온난화)에 의한 영향이 더 크게 작용할 가능성을 시사한다.

3. 산성화와 저염분 환경이 넙치 치어의 항산화 반응 및 세포 손상에 미치는 영향 CO2 배출 증가로 인한 기후 변화는 해수온을 상승시키고, 이는 해양의 pH 및 염분의 감소를 동반하게 된다. 이러한 해양의 염분 및 pH의 급격한 변화는 해양생물의 생존과 분포에 영향을 미치는 주요 환경 요인으로 작용한다. 그러나 현재까지의 환경 스트레스 관련 연구의 대부분은 염분, 수온 및 독성과 같은 단일 환경 변화에 따른 해양생물의 반응에 초점이 맞추어져 있다. 따라서 본 연구에서는 해양 산성화(낮은 pH)와 저염분의 복합적인 환경을 구성하기 위하여, CO2 노출 정도에 따라 2가지 pH 조건(8.1과 7.5)과 3가지 염분 조건[100%(34 psu), 80%(27 psu) 및 60% 해수(20 psu)]을 복합적으로 구성하여 다음과 같은 실험구를 설정하였다. 1. 대조구[pH 8.1 + 100%(34 psu) 해수], 2. 저염분 단일 환경 실험구[pH 8.1 + 80%(27 psu), pH 8.1 + 60%(20 psu)], 3. 산성화 단일 환경 실험구[(pH 7.5 + 100%(34 psu) 해수], 4. 산성화와 저염분이 결합된 복합 환경 실험구[pH 7.5 + 80%(27 psu), pH 7.5 + 60%(20 psu)]. 넙치 치어를 각각의 실험구 환경에 노출시킨 후, 산화스트레스 및 항산화 반응을 평가하기 위하여 cortisol, SOD, CAT 및 caspase-3 활성을 분석하였다. 또한, 염분 및 pH 변화에 따른 생리학적 반응을 평가하기 위하여 넙치 치어의 간 조직에서 SOD 활성 및 세포사멸 정도를 분석하였다. 그 결과, 저염분 단일 환경에서는 대조군 및 80% 해수에 비하여 60% 해수 실험구에서 전반적으로 산화스트레스(Cortisol), 항산화 효소(SOD, CAT)의 활성 및 세포사멸(caspase-3)의 빈도가 증가하는 경향을 보였다. 산성화 단일 환경에서는 노출 초기(7일)에는 산화스트레스 및 항산화 활성이 높게 나타났으며 세포사멸 빈도 또한 높게 관찰되었으나, 노출 시간이 경과(21일차) 함에 따라 대조구와 유사한 수준을 보였다. 그러나 산성화와 저염분의 복합 환경에서는 산성화 단일 환경과는 대조적으로 노출 초기(7일차)에는 산화스트레스 및 항산화 반응이 낮게 관찰되었으나, 노출 시간이 경과(21일차) 함에 따라 저염분 단일 환경과 유사한 수준을 보였다. 또한, 산화스트레스 및 항산화 효소의 활성과 세포사멸 빈도의 경우, 노출 초기에는 산성화와 저염분의 복합 환경에 비하여 산성화 단일 환경에서 높게 나타났으나, 노출 시간이 경과함에 따라 산성화 단일 환경에 비해 산성화와 저염분의 복합 환경에서 다시 높은 활성을 나타내었다. 즉, 산성화가 어류에게 스트레스 요인으로 작용하기 위해서는 어느 정도의 시간이 필요하며, 산성화 환경에 대한 넙치 치어의 생리학적인 변화는 순응 초기에 유의적으로 높게 발생하는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때 저염분 환경은 넙치 치어에게 산화스트레스를 유발하고 항산화 시스템의 활성화와 세포의 손상을 야기하였으나, 산성화 단일 환경 및 산성화와 저염분의 복합 환경에서는 노출 초기(7일차)에만 산화스트레스와 항산화 효소의 활성이 달리 나타나는 등 서로 다른 양상을 보였을 뿐, 그 이후부터는 산성화 단일 환경은 대조구와 유사한 수준을 보였으며, 산성화와 저염분의 복합 환경은 저염분 환경과 유사한 수준을 보였다. 즉, 본 연구의 초기 가설과는 달리 넙치 치어는 해수 산성화(pH 7.5) 환경에 노출된 후, 시간이 경과함에 따라 산화스트레스를 극복하여 산성화 환경에 적응했을 가능성이, 그리고 노출 시간이 경과함에 따라 산성화 단일 환경 보다는 저염분 단일 환경에서 산화스트레스가 더 높게 나타난 점 등으로 볼 때, 해양 산성화가 넙치의 산화스트레스 및 항산화 기작에 영향을 끼치고 있음은 확인할 수 있었지만, 저염분 스트레스 환경에 의한 영향이 더 크게 작용할 가능성을 시사한다.