Effect of Various Factors in the Environment on the Oxidative Stress Response and Apoptosis of Goldfish, Carassius auratus

Abstract

As pollutants such as plastics and heavy metals are discharged into the aquatic ecosystem due to industrialization, when fish are exposed to a polluted environment, oxidizing substances ROS and RNS are generated in the body. ROS includes O2-, H2O2 and OH-, and RNS includes NO and NO2. ROS and RNS can adversely affect cells in the body and cause oxidative stress, which can be a reason of apoptosis. In order to reduce this oxidative stress, antioxidant defense mechanisms work in the body, and in this process, antioxidant enzymes called SOD and CAT convert toxic ROS into nontoxic H2O and O2. In addition, MT is expressed in the body to reduce the toxicity of heavy metals. If harmful substances such as ROS and RNS are continuously present in the body, apoptosis could occur and even death of the individual. In this study, goldfish, Carassius auratus was exposed to micro-polystyrene and zinc with various water hardness, and the degree of oxidative stress and apoptosis occurring in the body was confirmed. The purpose of this study was to investigate the influence of the environmental factors to freshwater fish.

1. Effect of microplastic on the oxidative stress and apoptosis of goldfish Microplastic contamination in waterbodies is a growing source of concern for researchers and other stakeholders. We investigated oxidative stress and toxicity in goldfish, Carassius auratus in response to exposure to 1 µm diameter micro-polystyrene (MP) at concentrations of 0, 10, 100, and 1000 beads/mL (MP 0, MP 10, MP 100, and MP 1000 groups) for 7 d (at day 0, 1, 3, 5, and 7). We analyzed the survival rates; superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) mRNA expression levels in the liver; SOD and CAT activity in the plasma; caspase-3 mRNA expression in the liver; and the levels of hydrogen peroxide (H2O2) in plasma. Terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assays were also conducted to determine apoptosis levels in the liver. All fish in the MP 1000 group died by day 7 and the MP 100 group had a lower survival rate than the MP 10 and MP 0 groups. The mRNA expression as well as SOD, CAT, and caspase-3 activity levels were increased significantly with increases in MP concentration and exposure time. Finally, according to the TUNEL assay, more apoptosis was observed in the MP 1000 group at day 5 than in other groups. In summary, MP concentrations above 100 beads/mL caused death and oxidative stress to goldfish. I conclude that MP can cause oxidative stress and apoptosis in goldfish, which leads to death.

2. Effect of zinc and water hardness on the oxidative stress and apoptosis of goldfish I investigated the changes in toxicity stress in goldfish, Carassius auratus, under exposure to different concentrations of Zn and water hardness for 14 days. I analyzed the changes in water hardness and Zn accumulation after exposure. To investigate the stress levels, the expression of metallothionein, caspase-3 activity, NO activity, and total antioxidant capacity were detected. TUNEL assays were also performed to measure apoptosis in the liver. The results showed that compared to the control group, a more significant difference in the accumulation of Zn in body stress markers (metallothionein, caspase-3 activity, NO activity, and total antioxidant capacity) were observed with increasing Zn concentration and exposure time. Notably, at the same Zn concentration and exposure time, lower stress levels were discovered in the samples under harder water conditions. Finally, the TUNEL assay showed that Zn accumulation caused apoptosis and high water hardness could reduce the apoptosis. In conclusion, we found that high water hardness can influence the absorption of Zn, and alleviating the hardness levels can reduce the toxicity stress caused by Zn. |산업화가 진행됨에 따라 미세플라스틱 및 중금속과 같은 오염물질이 수생 생태계로 배출되는데, 이러한 오염 환경에 어류가 노출되는 경우에는 체내에서 산화물질인 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 활성질소종 (reactive nitrogen species, RNS)이 생성된다. ROS에는 superoxide (O2-), hydrogen peroxide (H2O2)와 hydroxyl radical (OH-) 등이 포함되며, RNS에는 nitric oxide (NO)와 nitric dioxide (NO2)가 대표적인 것으로 알려져 있는데, ROS 및 RNS 모두 생물체에 악영향을 끼쳐 체내에서 산화스트레스를 유발한다. 생물체는 이러한 산화스트레스를 감소시키기 위하여 체내에서 항산화 방어 메커니즘을 작동시키는데, 이 과정에서 superoxide dismutase (SOD)와 catalase (CAT)와 같은 항산화 효소가 역할을 진행하여 유독한 ROS를 무독한 H2O와 O2로 전환시킨다. 또한, 생물체는 독성으로 인하여 발생된 스트레스를 감소시키기 위하여 metallothionein (MT)이 발현되기도 한다. 이렇게 어류를 포함한 생물체는 체내에 ROS와 RNS가 다량으로 존재하게 되면 세포사멸이 발생되고 이는 폐사로 이어질 수 있다. 본 연구에서는 다양한 오염 환경 요인이 어류의 산화스트레스 및 세포사멸에 미치는 영향에 대하여 확인하고자, 담수어류인 금붕어, Carassius auratus를 micro-polystyrene (MP) 환경과 중금속인 아연 및 물 경도의 복합적인 환경에 노출시킨 후, 체내에서 발생하는 산화스트레스를 제어하기 위한 항산화 반응에 대하여 조사하였다.

1. 금붕어의 산화스트레스와 세포사멸에 미치는 미세플라스틱의 영향 본 연구에서는 금붕어를 10, 100 및 1000 beads/mL 농도의 micro-polystyrene (MP)에 7일간 노출시킨 후 금붕어 체내에서 발생되는 산화스트레스와 세포사멸의 변화를 확인하였다. 각각의 MP 실험구별로 금붕어의 생존율을 파악하였으며, 간 조직에서 항산화 관련 유전자인 SOD, CAT 그리고 세포사멸 관련 caspase-3 mRNA 발현을 분석하였고, 혈장에서는 SOD, CAT 및 H2O2 활성을 분석하였다. 또한, MP 노출에 따른 세포사멸 정도를 가시적으로 확인하기 위하여 transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay를 진행하였다. 그 결과, 1000 beads/mL 농도의 MP에 노출시킨 금붕어는 노출 7일째 모두 폐사하였고, 100 beads/mL 농도의 MP 실험구의 금붕어는 대조구에 비하여 낮은 생존율을 보였다. SOD, CAT 및 caspase-3 mRNA 발현량은 MP에 노출되는 시간이 경과할수록 그리고 MP의 농도가 증가할수록 유의하게 증가되었음을 확인할 수 있었다. 혈장에서 SOD 및 CAT 활성 또한 mRNA 발현량 변화와 유사한 경향을 보였다. 또한, TUNEL assay 분석 결과를 통하여 노출 5일째의 1000 beads/mL 농도 MP 실험구에서 세포사멸이 유의적으로 높게 나타났음을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과를 종합해 보면, 100 beads/mL 이상 농도의 MP는 금붕어에게 산화스트레스의 발생을 촉진시켜 세포사멸을 유발하는 등의 악영향을 미칠 수 있는 것으로 판단된다. 2. 금붕어의 산화스트레스와 세포사멸에 미치는 아연 및 물 경도의 복합적인 영향 본 연구에서는 금붕어를 다양한 농도의 아연(Zn)과 다양한 물 경도의 복합적인 환경에 14일간 노출시킨 후, 금붕어 체내에 축적되는 Zn의 양적 변화를 분석하였으며, 산화스트레스의 변화를 알아보기 위하여 MT 및 nitric oxide synthase (iNOS) mRNA 발현, nitric oxide (NO) 활성 및 total antioxidant capacity (TAC)를 분석하였다. 또한, 간 조직에서 세포사멸 정도를 확인하기 위하여 caspase-3 활성을 측정하였고, 세포사멸 정도를 가시적으로 확인하기 위하여 TUNEL assay를 진행하였다. 그 결과, 쿠의 농도가 높아지고, 노출 시간이 경과할수록 금붕어 체내에 축적되는 Zn의 양이 증가하였을 뿐만 아니라, 다양한 스트레스 지표(MT, iNOS mRNA 발현, NO 활성 및 TAC) 또한 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 그러나 Zn의 농도와 노출 시간이 동일했음에도 사육수의 경도가 높아짐에 따라 금붕어 체내에서 Zn의 축적 및 스트레스 지표는 유의하게 감소되었음이 확인되었다. 또한, caspase-3 활성 및 TUNEL assay로 세포사멸 정도를 분석한 결과에서도 동일한 농도의 Zn 실험구임에도 불구하고 사육수의 경도가 높아지면 세포사멸이 감소되었음이 확인되었다. 본 연구 결과를 종합해 보면, 금붕어는 0.5 mg/L 보다 높은 농도의 Zn에 노출될 경우, 체내에서 산화스트레스가 유발되었음은 물론 세포사멸 또한 유도되었다. 그러나 사육수의 경도가 높아짐에 따라 Zn의 체내 축적이 감소된 결과로 보아, 높은 수준의 물 경도는 Zn의 독성 성분 노출로 인하여 금붕어 체내에서 발생된 산화스트레스 및 세포사멸을 감소시키는데 효과적인 것으로 판단되었다.