다양한 환경 스트레스 요인에 노출된 참굴, Crassostrea gigas의 분자생물학 및 생리학적 변화에 관한 연구

Abstract

1. 고염분 스트레스에 노출된 참굴의 HSP90, SOD, CT-R mRNA 발현 및 헤모림프 생리학적 반응

고염분(52.5 psu) 스트레스에 노출된 참굴의 아가미 조직으로부터 전장의 heat shock protein 90 (HSP90) cDNA (GenBank accession no. EF687776)를 클로닝하였다. Superoxide dismutase (SOD)와 calcitonin-related receptor (CT-R)의 degenerate primer는 이미 보고되어 있는 염기배열을 참고로 하여 설계하였다. 참굴의 HSP90, SOD 및 CT-R mRNA의 발현량은 고염분 스트레스에 노출시킨 후, 72, 96, 192시간째까지 각각 유의하게 증가하였으며, 헤모림프의 삼투질 농도와 Na^(+), Cl^(-) 및 Ca^(2+) 이온 농도는 고염분 스트레스에 노출시킨 후 72시간째에, hydrogen peroxide (H₂O₂) 농도는 192시간째에 각각 최대값을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 염분 스트레스에 의하여 체내에서 발생된 활성산소로부터 세포의 구조와 기능을 보호하기 위하여 HSP90 mRNA의 발현이 유도되었으며, 발생된 활성산소를 제거하고 세포를 보호하기 위한 일종의 방어기작으로서 SOD mRNA가 발현·작용한 것이라고 판단된다. 또한, CT-R mRNA는 참굴 체내의 Ca^(2+) 이온 농도 조절을 위하여 발현량이 증가한 것이라고 판단된다. 본 연구에서는 고염분 스트레스에 노출된 참굴의 생리학적 반응을 평가하기 위하여 HSP90, SOD, CT-R mRNA의 발현량의 변화뿐만 아니라 헤모림프의 삼투압과 Na^(+), Cl^(-) 및 Ca^(2+) 이온 농도의 변화를 조사하여 그 상관관계를 파악하였다.

2. 수온 스트레스에 노출된 참굴의 CYP450, HSP90, SOD mRNA 발현 및 헤모림프 생리학적 반응

급격한 수온 변화(30℃, 10℃)에 노출된 참굴의 아가미 조직으로부터 전장의 cytochrome P450 (CYP450) cDNA (EF451959)를 클로닝하였다. 참굴을 급격한 수온 변화에 노출시킨 후, 참굴의 아가미 조직에서 CYP450, HSP90 및 SOD mRNA의 발현량을 시간대별로 조사한 결과, 노출 후 6시간째까지 실험에 사용된 모든 유전자의 발현량이 유의하게 증가한 후 감소하는 경향을 나타내었다. 또한, 참굴을 고수온(30℃) 환경에 노출시킨 후 6시간째에 헤모림프의 H₂O₂ 농도와 aspartate aminotransferase (AST)의 활성이 최대값을 나타내었으며, 노출 후 24시간째에는 삼투질 농도가 최대값을 나타내었다. 이와 같은 결과로 볼 때, CYP450 mRNA는 참굴이 수온변화에 적응하는 과정동안 어떠한 역할을 담당하고 있을 가능성을 시사하고 있다. HSP90 mRNA는 참굴 체내의 세포보호 기작의 하나로써 발현되었을 것이며, 급격한 수온변화에 의하여 생성된 산화 스트레스 요인을 제거하기 위하여 SOD mRNA의 발현량이 증가된 것으로 판단된다. 그러나 고수온 스트레스에 노출시킨 후 참굴 아가미 조직의 변화상을 hematoxylin-eosin (H-E) 이중 염색법과 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)을 사용하여 관찰한 결과, 실험 종료시까지 대조구와 비교하여 어떠한 조직학적 변화도 관찰되지 않았다. 이와 같은 사실은 수온 스트레스로 인하여 체내에서 다량으로 발생된 활성산소의 제거 및 세포를 보호하기 위한 방어기작으로서 CYP450, HSP90 및 SOD mRNA가 발현된 것으로 사료되나, 수온 스트레스 요인만으로는 단백질 변성 등으로 인한 세포의 조직학적 변화에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

3. 카드뮴에 노출된 참굴의 항산화효소(SOD, CAT 및 GPX) mRNA 발현 및 헤모림프 생리학적 반응

카드뮴에 노출된 참굴의 아가미 조직으로부터 전장의 catalase (CAT) cDNA (EF687775)와 glutathione peroxidase (GPX) cDNA (EF692639)를 클로닝하였다. 카드뮴 0.01과 0.05 ppm 농도에 노출시킨 후, 1, 3, 7, 11일간의 처리시간 경과에 따라 SOD, CAT 및 GPX mRNA 발현량의 변화를 조사한 결과, 모든 항산화 유전자(SOD, CAT 및 GPX)의 발현량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 카드뮴 0.1 ppm에 노출 후, 3일째까지는 실험에 사용된 모든 항산화 유전자의 발현량이 유의적으로 증가하는 경향이 나타났다. 한편, 노출 7일째에 SOD mRNA의 발현량은 증가하였으나, CAT와 GPX mRNA 발현량은 감소하는 경향을 나타내었다. 이와 동시에 헤모림프에서는 AST, alanine aminotransferase (ALT) 활성과 H₂O₂ 농도의 증가가 관찰되었다. 참굴 아가미 조직의 변화상을 H-E 이중 염색법과 TEM을 사용하여 관찰한 결과, H-E 이중염색법으로는 실험 종료시까지 대조구와 비교하여 어떠한 조직학적 변화도 관찰되지 않았으나, TEM을 사용하여 관찰한 결과, 카드뮴 0.05 ppm에 노출시킨 후 11일째와 0.1 ppm에 노출시킨 전 실험구의 아가미 조직에서 미세융모의 팽창 등으로 인한 섬모의 손상이 관찰되었다. 그러나 세포의 변형이나 공포의 발생, 세포내의 핵이나 미토콘드리아 등에 영향을 미치는 극심한 세포 손상까지는 진행되지 않은 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 볼 때, 참굴 체내에서는 고농도의 카드뮴 독성에 의하여 발생된 과도한 활성산소(산화 스트레스)를 제거하기 위하여 SOD mRNA가 발현된 것으로 판단된다. 또한, SOD에 의하여 자연적으로 생성된 H₂O₂는 CAT와 GPX에 의한 2차 항산화 시스템에 의한 해독 능력이 상실(저하)됨으로써 참굴 아가미의 섬모의 손상에 영향을 끼친 것이라고 판단된다. 따라서 항산화 유전자인 SOD, CAT 및 GPX mRNA의 발현은 카드뮴 오염에 따른 참굴의 생리적 지표로서 활용될 수 있는 가능성을 시사하고 있다.

4. 저산소 스트레스에 노출된 참굴의 항산화효소 mRNA 발현 및 헤모림프 생리학적 반응

저산소 스트레스에 노출된 참굴의 산소소비량은 개체당 0.3 mg/L이었으며, 밀폐된 호흡실에서 참굴이 용존산소를 소비함에 따라 저산소 환경이 형성되어졌다. 항산화 효소인 SOD mRNA의 발현량은 저산소 스트레스에 노출시킨 후 1시간째까지는 증가한 후 감소하였으며, CAT와 GPX mRNA의 발현량은 저산소 스트레스에 노출시킨 후 지속적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 저산소 환경에서는 superoxide radical (O₂^(-))을 H₂O₂와 O₂로 전환시키는 SOD의 1차적인 항산화 방어체계까지는 정상적으로 작동되어지나, O₂^(-)에서 전환된 H₂O₂를 O₂와 H2O로 분해하는 CAT와 GPX에 의한 2차적인 방어체계가 정상적으로 작동되지 않은 것으로 판단된다. 따라서 참굴 체내에서는 유해한 H₂O₂가 완전히 제거되지 못하게 됨으로써 H₂O₂에 의한 독성이 참굴에 악영향을 끼치게 되는 것으로 판단된다. 그러나 저산소 스트레스에 노출된 참굴 아가미 조직의 변화상을 H-E 이중 염색법과 TEM을 사용하여 관찰한 결과, 실험 종료시까지 대조구와 비교하여 어떠한 조직학적 변화도 관찰되지 않았다.

본 연구에서 제시된 다양한 스트레스 환경요인에 따른 참굴의 생리활성도의 변화를 분자생리학적 측면에서 조사해 본 결과, 다양한 스트레스 환경에서 생존이 가능한 최소한의 서식환경에 따른 bio-marker를 도출해 낼 수 있었다. 또한, 이러한 연구 결과는 다양한 환경변화에 노출된 패류종의 생리적 현상을 파악할 수 있는 환경·생리학적 측면의 bio-marker로서 이용할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.