클리너 새우 Lysmata amboinensis의 환경 및 성숙 반응에 관한 분자내분비학적 연구

Abstract

Cleaner shrimp Lysmata amboinensis is a decapod crustacean inhabiting the tropical coral reefs. It is a tropical shrimp that is popular among marine species collectors because of very beautiful stripe pattern of red color. In addition, the species maintains a unique symbiotic relationship with host fishes, especially moray eel. It occupies an important position not only in the ecological aspect of the tank but also in the commercial aspect. In particular, it has been termed as "cleaner shrimp" owing to its maintenance of an unusual symbiotic cleaning relationship that eliminates parasites, bacteria, and damaged tissues in host fishes. Despite its high commercial position, however, there is a lack of knowledge about molecular mechanisms involved in photoreactions as well as fundamental physiological responses to these species. Therefore, this study was carried out to clarify the effects of specific wavelengths on the physiological response and environment of cleaner shrimp by light, and also to investigate whether regulation of sex-related hormones secreted from the eyestalk, an important organ in crustaceans. 1. Effects of various photoperiods and specific wavelength lights on circadian rhythm in cleaner shrimp Lysmata amboinensis Cleaner shrimp, Lysmata amboinensis, is an ornamental crustacean that is important both commercially, in the aquarium industry, and ecologically, owing to its symbiotic relationship with host fishes. In order to establish a symbiotic relationship with host fishes, the cleaner shrimp inevitably work during the daytime despite being nocturnal, and is highly sensitive to light, particularly, in the 480–540 nm range. However, there have been few studies on the physiological characteristics of this species. In this study, I investigated effect of photoperiod and specific wavelength (red, 630 nm; green, 520 nm; 및 blue, 455 nm) on the circadian rhythm of cleaner shrimp. Circadian rhythm was evaluated by quantifying the mRNA expression of clock genes such as lysmata amboinensis cryptochrome1 (laCry1) and lysmata amboinensis period 2 (laPer2) and melatonin concentration. The mRNA levels of clock genes were significantly higher at daytime than at night-time. Furthermore, at the red and green wavelengths, the difference in clock gene mRNA levels between day and night was significantly higher than that observed under white fluorescent light. Melatonin levels showed the opposite trend. Collectively, the findings demonstrate that the photoperiod regulates the biological rhythm of the cleaner shrimp and that the irradiation wavelength affects the biological rhythm. In particular, the red and green wavelengths appeared to be linked to the clock gene rhythm and melatonin levels.

2. Effects of specific wavelength lights on stress responses and cell damage in cleaner shrimp Lysmata amboinensis exposed to various salinity conditions Living creatures in the aquatic environment exhibit a variety of physiological responses due to environmental factors, especially cleaner shrimp, which are more often breed as ornamental species than when they are inhabited in nature, are often exposed to various salinity condition by inexperienced administrators. It is a stress response factor and eventually causes mortality. Therefore, in this study, I investigated the effects of specific wavelengths of light on various salinity condition in order to reduce salinity stress through improvement of rearing device. Cleaner shrimp were exposed to low salt environment (25 and 30 psu) and high salinity environment (40 and 45 psu) for 3 days based on normal sea salt (35 psu), while irradiating specific wavelength light. Na+/K+-ATPase (NKA) activity in gills and glucose levels in whole-body fluids were measured as ionic homeostasis reactions, and the heat shock protein 70 (HSP70) concentration in tissues (gill, hepatopancreas and muscle) was measured as physiological stress reaction, and the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), lipid peroxidation (LPO) in tissues (gill, hepatopancreas and muscle) and the nuclear damage in hepatopancreas were measured by the oxidative stress reaction. As a result, all shrimp exposed to 45 psu were dead within a day of exposure. Although all experimental groups showed negative responses to changes in salinity, the groups exposed to green and red wavelengths of light showed milder negative effects than the groups exposed to blue and fluorescent light. In conclusion, there was no difference in the effect of different intensities of light, but green and red light effectively reduced the osmotic stress and cell damage caused by salinity.

3. Effects of E2 injection and red wavelength light on eyestalk hormones of cleaner shrimp Lysmata amboinensis The objectives of this study were to test the effects of 17β-estradiol (E2) injection and red light on sex maturation and vitellogeneisis of cleaner shrimp Lysmata amboinensis. Therefore, we mesured the change of mRNA expressions of the eyestalk hormones and vitellogenesis-related hormone according to E2 injection and red light irradiation. We used eyestalk genes such as crustacean hyperglycemic hormone (CHH) and vitellogenesis inhibiting hormone (VIH). E2 injection did not affect the changes of eyestalk hormones. However the red light caused a significant increase of CHH promoting maturity and a significant decrease of VIH which suppressed vitellogenesis. In addition, as result of vitellogenin receptor (VTG-R) and vitellogenin (VTG) mRNA expression (in-situ hybridization), E2 injection as well as red wavelength irradiation were shown to induce the synthesis of VTG. In conclusion, red light induce gonadal maturation promoting hormone and VTG synthesis. However, E2 does not change the eyestalk hormone. Therefore, it is considered that red light irradiation can be used as a new mature promotion alternative method which is different from the eyestalk ablation method which has been used at the culture field.|클리너새우는 열대 산호초 해역에 서식하는 십각목에 속하는 종으로, 붉은 색상의 아름다운 줄무늬 패턴으로 인하여 해양생물 수집가들에게 인기 있는 관상용 새우이다. 본 종은 거의 대부분을 자연 채집에 의존하고 있는 고가의 관상용 새우이기 때문에 산업적 가치가 클 뿐 아니라, 호스트 어류의 기생충이나 박테리아와 손상된 조직을 제거하는 등 특이한 공생관계를 갖는 특성을 보이기 때문에 생태학적 측면에서도 연구 가치가 큰 종이라 판단된다. 그러나 아직까지 클리너새우에 관한 연구는 거의 수행된 적이 없을 뿐만 아니라, 앞으로 해양생명자원의 관리 및 종 보존 측면의 연구를 수행하기 위해서는 본 종의 생리학적 특성에 관한 연구가 반드시 필요하다. 최근에는 어류의 성장, 성숙 측면의 생리학적 특성을 조절하여 안정적인 양식생물의 대량 생산체제를 구축하기 위하여 특정 파장대의 빛을 활용한 긍정적인 연구 결과가 발표되고 있다. 이러한 연구결과가 관상 가치가 높은 클리너새우의 양식 기술 개발에 보다 용이하게 활용되기 위해서는 특정 파장대의 빛에 의한 클리너새우의 생리 대사 조절 가능성을 확인하고, 빛 파장대별로 클리너새우에 미치는 영향을 파악하는 것이 필요하다. 하지만 갑각류인 클리너새우에서의 경우에는 광반응과 성숙을 포함한 분자 메커니즘 측면의 기본적인 정보조차 찾아보기 어려운 실정이다. 따라서 본 연구는 특정 빛 파장에 따른 클리너새우의 생리학적 반응을 조사하고 급격한 환경 변화에 노출된 클리너새우의 스트레스 반응 조절에 미치는 특정 빛 파장의 효과를 확인하기 위하여 수행되었다. 또한, 특정 빛 파장이 갑각류의 주요 기관 중의 하나인 안병에서 성 성숙에 영향을 미치는 호르몬의 분비를 조절하는지에 대해서도 조사하였다.

1. 클리너새우의 일주기리듬에 미치는 다양한 광주기 및 특정 빛 파장의 효과 일반적으로 새우류는 야행성 종임에도 불구하고 클리너새우는 호스트 어류와 공생관계를 이루기 위해서 불가피하게 낮 시간에 활동하는 것으로 보이며, 특히 480∼540 nm 범위의 파장대의 빛에 대해 반응한다고 알려져 있다. 그러나 행동학적 측면에서 본 종이 특정 파장대의 빛에 반응한다고만 알려져 있을 뿐, 광반응과 관련된 생리적 특성과 관련된 연구는 거의 찾아볼 수 없다. 따라서 본 연구에서는 우선 다양한 광주기(24시간 동안 지속적으로 빛을 조사한 실험구, LL; 12시간만 빛을 조사한 실험구, LD; 24시간 동안 빛의 조사가 없는 실험구, DD)와 특정 파장의 빛(적색, 630 nm; 녹색, 520 nm; 및 청색, 455 nm)이 클리너새우의 일주기리듬에 어떠한 영향을 미치는지에 대해서 조사하였다. 일주기/생체리듬을 조절하는 대표적인 시계유전자로 알려진 cryptochrome1 (Cry1)과 period2 (Per2) mRNA의 발현량 변화와 밤의 호르몬이라고 알려져 있는 melatonin의 농도 변화를 정량화하여 클리너새우의 일주기리듬을 확인하였다. 그 결과, 시계유전자인 Cry1과 Per2 mRNA의 발현량은 밤 시간대에 비하여 낮 시간대에서 유의적으로 높게 나타났다. 광주기별 시계유전자 mRNA의 발현량을 비교한 결과, LL 환경에서는 시계유전자 mRNA의 발현량이 높고 DD 환경에서는 낮은 발현량을 보였으며, LL 환경과 DD 환경에서 시계유전자의 발현량 변화 폭은 LD 환경에 비해 감소된 것을 확인하였다. 또한, 광주기 변화에 따른 melatonin 농도의 일주기 변화 패턴은 시계유전자 mRNA의 발현량 패턴과는 다르게 낮 시간대에 비하여 밤 시간대에 유의하게 높게 나타났다. Melatonin 농도는 LL 환경에서 낮게 나타났고 DD 환경에서 높게 나타났으며, LL 환경에서 melatonin 농도는 LD와 DD 환경에 비하여 주·야간에 따른 농도 변화의 폭이 감소한 것을 확인하였다. 또한, 적색과 녹색 파장 빛 실험구의 클리너새우에서 관찰된 Cry1과 Per2 mRNA의 발현 폭은 대조구로 사용된 형광등 실험구의 클리너새우에서 관찰된 발현 폭에 비하여 유의하게 높게 나타났다. 결론적으로 본 연구에서는 광주기와 특정 빛 파장이 다른 종에서와 같이 클리너새우의 일주기리듬과 melatonin의 농도 조절에 영향을 미친 것으로 판단되며, 특히 적색과 녹색 파장은 다른 빛 파장에 비하여 효과적으로 작용하고 있는 것으로 판단된다.

2. 염분변화 환경에 의해서 클리너새우에서 유도된 스트레스 반응 및 핵 DNA 손상에 미치는 특정 광 파장의 영향 수생생물은 서식 환경요인의 변화에 따라 다양한 생리학적 반응을 보이며, 자연 환경에 서식하는 경우에 비하여 관상용으로 소형 실내 수조에서 인위적으로 사육되는 경우에는 수분의 증발 등 급격한 염분변화를 포함한 다양한 환경변화에 빈번하게 노출되기 쉽다. 다양한 환경변화에 노출된 개체의 체내에서는 스트레스 반응이 유발되는데, 이를 조절하지 못하는 경우에는 폐사에 이르게 된다. 따라서 본 연구에서는 급격한 염분변화 환경에 노출된 클리너새우의 체내에서 유발된 스트레스가 특정 파장 빛의 조사로 인하여 조절될 수 있는지 여부와 그 영향을 조사하였다. 클리너새우를 일반적인 해수(35 psu)와 저염분 해수 (25 및 30 psu) 그리고 고염분 해수(40 및 45 psu) 환경에 각각 3일 동안 노출시킨 실험구에 다양한 파장대의 빛(적색, 630 nm; 녹색, 520 nm; 청색, 455 nm)을 실험구별로 조사하면서 클리너새우의 아가미 조직 내에서 Na+/K+-ATPase (NKA) 활성과 체액 내 glucose 농도를 측정하였다. 또한, 생리학적 스트레스 반응을 확인하기 위하여 아가미, 간췌장과 근육에서 heat shock protein 70 (HSP70) 농도를 측정하였으며, 산화스트레스 반응을 확인하기 위하여 대표적인 항산화효소인 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), lipid peroxidation (LPO) 농도를 측정하고, comet assay 분석을 통하여 핵 DNA의 손상 정도를 측정하였다. 그 결과, 45 psu 고염분 실험구의 클리너새우는 하루 만에 모두 폐사하였다. 그러나 다른 모든 실험구의 클리너새우에서 측정된 NKA 활성과 glucose 농도뿐만 아니라, HSP70, SOD, CAT, LPO 농도와 핵 DNA의 손상 정도 값 모두 대조구(35 psu)에 비하여 유의적으로 높게 나타난 점으로 보아, 클리너새우는 염분변화에 의해서 (산화)스트레스를 받는 것을 확인할 수 있었다. 적색과 녹색 파장의 빛을 조사한 실험구의 클리너새우에서는 대조구와 청색 파장 실험구에 비하여 (산화)스트레스가 유의적으로 감소하였는데, 파장의 강도에 의한 영향은 거의 없는 것으로 확인되었다. 또한, 간췌장 세포 내에서 핵 DNA의 손상 정도를 확인한 결과, 25, 30 및 40 psu 실험구에서는 대조구에 비하여 tail length와 % DNA 값이 노출 시간이 경과함에 따라 유의적으로 증가하였다. Tail length와 % DNA 값 모두 적색과 녹색 파장에 노출된 실험구의 클리너새우 간췌장 세포에서는 유의적으로 낮게 나타난 반면, 청색 파장 실험구에서는 높은 값을 나타내었다. 결론적으로 적색과 녹색 파장의 빛은 클리너새우의 스트레스를 저감시킬 뿐만 아니라, 항산화 능력 또한 증강시켜 핵 DNA의 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것으로 분석되었다.

3. 17β-estradiol 및 적색 파장의 빛이 클리너새우의 성숙 관련 안병 호르몬 분비와 난황 형성에 미치는 영향 갑각류는 어류와는 달리 안병 내에 존재하는 X-Organ/sinus gland complex라는 특수한 조직에서 분비되는 다양한 호르몬을 통해서 성 성숙이 진행된다. 최근에는 갑각류의 흉부신경절과 뇌에서 척추동물에 존재하는 형태의 성 스테로이드 호르몬이 발견되면서 다양한 성 성숙 메커니즘 경로가 있는 것으로 알려지면서 갑각류의 X-Organ/sinus gland complex에서 분비되는 성 성숙 관련 호르몬과의 상호작용에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다. 따라서 본 연구에서는 갑각류에서 성 성숙을 유도하기 위하여 일반적으로 사용되는 안병 절제 방법의 문제점을 개선하고, 성 성숙과 빛의 상관관계를 조사하여 빛을 수용하는 기관인 안병을 절제하지 않고도 성 성숙을 유도할 수 있는 새로운 갑각류의 성 성숙 방법을 제시하고자 한다. 즉, 본 연구는 클리너새우의 성 성숙을 유도하기 위하여 17β-estradiol (E2)를 주입하는 방법과 적색 파장 빛을 조사하는 방법이 안병에서 생성되는 성숙 관련 호르몬인 crustacean hyperglycemic hormone (CHH)과 vitellogenesis- inhibiting hormone (VIH)의 변화량에 미치는 영향을 확인하였다. 또한, in-situ hybridization 방법을 통하여 간췌장에서 vitellogenin (VTG) mRNA의 발현 변화를 직접 확인하였으며, 생식소에서는 vitellogenin 수용체 (VTG-R) mRNA의 발현 변화를 확인하여 E2와 적색 파장의 빛이 클리너새우의 난황형성과정에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, E2 주입은 안병 호르몬의 변화에 영향을 미치지 않았지만, 적색 파장 빛의 조사는 갑각류의 성숙을 촉진하는 CHH mRNA의 발현을 유의적으로 증가시켰으며 동시에 성숙과 난황 형성을 억제하는 VIH mRNA의 발현까지도 유의적으로 감소시켰다. 또한, E2의 주입 및 적색 파장 빛의 조사로 인하여 VTG 및 VTG-R mRNA의 발현이 증가된 것으로 보아, E2와 적색 파장의 빛은 클리너새우의 VTG 합성을 유도하는데 효과적임을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 적색 파장의 빛은 성숙 촉진 호르몬의 유도와 난황형성을 촉진하는 파장대의 빛으로 사료되며, E2는 성숙을 촉진하는 안병 호르몬에 영향을 미치지 않는다는 사실을 확인하였다. 이러한 연구결과는 갑각류의 성 성숙을 유도할 때 안병을 절제하는 기존의 방법과는 달리, 적색 파장 빛을 조사하는 방법을 사용하게 된다면 안병의 절제로 인하여 관상용 클리너새우의 미관을 해치게 될 수도 있는 단점을 극복할 수 있을 뿐만 아니라 갑각류의 성 성숙을 위한 효과적인 방법으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 최근에 알려지기 시작한 특정 파장대의 빛이 어류의 성장, 면역 및 성숙에 긍정적인 영향을 미친다는 연구결과를 대중성이 높은 갑각류인 클리너 새우에 접목하여 다양한 파장대의 빛이 클리너새우의 생리학적 측면에 미치는 영향에 대한 중요한 정보를 제공하고 있다. 특히, 적색 파장대의 빛은 시계유전자의 일주기 리듬을 조절할 뿐만 아니라 급격한 환경 변화에 노출된 클리너새우의 스트레스 반응 조절 그리고 성 성숙에 영향을 미치는 안병호르몬의 조절에도 효과적인 것을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 중요한 양식 대상 종인 클리너새우에 대한 기본적인 분자내분비학적 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 안정적인 양식생산에 필요한 기초 데이터로도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.